編者按：晚期非小細胞肺癌除了常見的EGFR基因突變外，還存在一些少見或罕見的驅動基因突變，對這些基因也應選擇相應的檢測平臺進行檢測。為了讓大家了解肺癌罕見基因檢測的平臺選擇和檢測方法，本文除了介紹常見EGFR基因檢測外，重點介紹了肺癌少見和罕見驅動基因檢測的平臺和方法。
NCCN指南推薦晚期非小細胞肺癌（NSCLC）患者常見的基因異常類型為基因突變、基因過表達、基因融合等。一般情況下都應當進行腫瘤組織或脫落癌細胞的EGFR、ALK突變檢測，以明確靶向藥物的敏感位點和可能存在的耐藥情況。對EGFR和ALK突變陰性的NSCLC患者可嘗試進行ROS-1、RET、c-MET、PD-L1、NTRK及Her-2等罕見基因檢測[1]。
常規EGFR和ALK的突變通常采用以下方法和平臺：
1）EGFR點突變、插入/缺失：主要是EGFR L858R、EGFR-19del、EGFR T70M和EGFR-E20ins，是基于DNA水平上的改變，臨床上常用的檢測方法有ARMS-PCR、NGS、dPCR等。主要包括EGFR最主要的突變位點外顯子19缺失（19del）和外顯子21點突變（L858R），同時還包括外顯子18點突變（G719X），外顯子20插入突變（20ins）和點突變（T790M、S768I），外顯子21點突變（L861Q）等。對于這些已知突變，常規組織樣本推薦采用ARMS-PCR法，檢測時間短且檢測費用相對較低?；趒RT-PCR的方法，需要根據EGFR基因已知的突變類型設計引物探針，無法檢測出所有可能的突變，但靈敏度相對較高，操作簡單，無需對PCR產物進行操作，在很大程度上避免了擴增產物的污染，易于在臨床開展，是目前EGFR 基因突變檢測最常用的檢測技術之一。二代測序是一種高通量測序技術，能夠同時對多基因、多位點進行測序。二代測序檢測EGFR基因突變，檢測位點更加全面，可以發現罕見突變位點，為晚期NSCLC患者的全流程管理提供依據。
2）ALK基因重排/融合：ALK Ventana D5F3 IHC檢測方法是目前最快速、經濟的方法。該判讀標準僅適用于肺腺癌，該檢測在用于鱗癌、神經內分泌癌等其他類型肺癌標本時應謹慎，疑似陽性標本需要使用其他方法進行驗證。FISH檢測是檢測ALK重排的“金標準”，檢測結果判讀直觀，對樣本質量要求較低，但費用較高、經濟效益比不佳。并且在FISH判讀時，對于處于臨界值分離信號、不典型分離信號等的判定需要格外謹慎，推薦利用其他技術平臺復核檢測?；趒RT-PCR方法的ALK融合基因檢測具有較高的靈敏度和特異度，但因為qRT-PCR只能檢測已知ALK融合基因類型，所以存在假陰性。另外，由于qRT-PCR基于mRNA擴增技術，因此實驗室內、外部質控等應制定最嚴格的技術標準，防止污染。二代測序對ALK基因融合通過捕獲平臺在DNA/RNA水平或擴增子平臺在RNA水平上進行檢測。但對于質控不合格或結果不典型病例，報告時應加備注，并建議使用其他技術平臺進行復檢。同時當二代測序在血液中檢出ALK基因變異時，應注意假陰性結果的出現。
1）EGFR點突變、插入/缺失：主要是EGFR L858R、EGFR-19del、EGFR T70M和EGFR-E20ins，是基于DNA水平上的改變，臨床上常用的檢測方法有ARMS-PCR、NGS、dPCR等。主要包括EGFR最主要的突變位點外顯子19缺失（19del）和外顯子21點突變（L858R），同時還包括外顯子18點突變（G719X），外顯子20插入突變（20ins）和點突變（T790M、S768I），外顯子21點突變（L861Q）等。對于這些已知突變，常規組織樣本推薦采用ARMS-PCR法，檢測時間短且檢測費用相對較低?；趒RT-PCR的方法，需要根據EGFR基因已知的突變類型設計引物探針，無法檢測出所有可能的突變，但靈敏度相對較高，操作簡單，無需對PCR產物進行操作，在很大程度上避免了擴增產物的污染，易于在臨床開展，是目前EGFR 基因突變檢測最常用的檢測技術之一。二代測序是一種高通量測序技術，能夠同時對多基因、多位點進行測序。二代測序檢測EGFR基因突變，檢測位點更加全面，可以發現罕見突變位點，為晚期NSCLC患者的全流程管理提供依據。
2）ALK基因重排/融合：ALK Ventana D5F3 IHC檢測方法是目前最快速、經濟的方法。該判讀標準僅適用于肺腺癌，該檢測在用于鱗癌、神經內分泌癌等其他類型肺癌標本時應謹慎，疑似陽性標本需要使用其他方法進行驗證。FISH檢測是檢測ALK重排的“金標準”，檢測結果判讀直觀，對樣本質量要求較低，但費用較高、經濟效益比不佳。并且在FISH判讀時，對于處于臨界值分離信號、不典型分離信號等的判定需要格外謹慎，推薦利用其他技術平臺復核檢測?；趒RT-PCR方法的ALK融合基因檢測具有較高的靈敏度和特異度，但因為qRT-PCR只能檢測已知ALK融合基因類型，所以存在假陰性。另外，由于qRT-PCR基于mRNA擴增技術，因此實驗室內、外部質控等應制定最嚴格的技術標準，防止污染。二代測序對ALK基因融合通過捕獲平臺在DNA/RNA水平或擴增子平臺在RNA水平上進行檢測。但對于質控不合格或結果不典型病例，報告時應加備注，并建議使用其他技術平臺進行復檢。同時當二代測序在血液中檢出ALK基因變異時，應注意假陰性結果的出現。
其他涉及到的罕見基因主要由ROS1、RET基因重排/融合等，可以采用的檢測方法有免疫組化、FISH、ARMS-PCR和NGS。其中RET突變可通過FISH或NGS檢測，但也可通過IHC、逆轉錄PCR（RT-PCR）和循環腫瘤 DNA（ctDNA）檢測。
1）ROS1基因重排/融合表達檢測各種方法學與ALK相似，但IHC抗體特異性不佳，目前不能直接用于檢測ROS1基因重排/融合表達，僅可用于ROS1基因融合初篩?；趒RT-PCR方法的ROS1融合基因檢測具有較高的靈敏度和特異度，且可與ALK聯檢。FISH檢測是檢測ROS1重排的“金標準”。二代測序檢測ROS1基因變異同樣可在DNA水平上檢測重排序列，也可在mRNA水平檢測融合序列，但由于ROS1基因序列的特殊性，基于DNA水平的二代測序檢測靈敏度受文庫探針設計及生物信息學分析能力影響較大，應注意假陰性。
2）MET跳讀突變：MET第14號外顯子跳躍突變的檢測，包括二代測序或qRT-PCR直接檢測缺失MET第14號外顯子的mRNA，或二代測序在DNA水平上檢測可能導致MET第14號外顯子剪切的基因變異。MET基因探針覆蓋范圍不夠可能導致基于DNA的二代測序發生漏檢，建議二代測序檢測應盡量涵蓋第14號外顯子外的如第13或14號內含子上可能發生剪切變異的區域。原位雜交檢測是檢測MET擴增的標準方法。相較于FISH，二代測序可用于MET擴增檢測，但與FISH檢測的對應性比較復雜，并可能遺漏MET多體，但是二代測序可同時檢測MET突變和融合等其他變異，且能實現多基因共檢，在臨床實踐中應用更廣。
3）蛋白過表達：NSCLC中蛋白過表達可用于指導臨床靶向治療的基因有HER、NTRK和PD-L1，通過IHC檢測腫瘤細胞和/或免疫細胞PD-L1的表達水平是目前判斷NSCLC患者能否從免疫檢查點抑制劑治療中得到更多獲益的主要評估手段。目前我國已批準3種標準化的PD-L1檢測商用試劑盒用于臨床檢測，包括配套Dako平臺的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx試劑盒及濃縮液、PD-L1 IHC 28-8 pharmDx試劑盒以及配套Ventana檢測平臺SP263試劑盒。不同單抗和IHC染色平臺的使用、PD-L1染色陽性截斷值的設定與相應的免疫治療藥物療效相關。PD-L1檢測所用抗體克隆不同其陽性閾值不同。除了上述靶分子外，HER2基因突變或擴增、BRAF突變、KRAS突變、RET基因重排、NTRK家族基因重排等的檢測方法可參照基因點突變、基因重排類型的檢測方法和檢測策略，更多的尚需臨床實踐的積累。表1列舉了非小細胞肺癌常用分子病理檢測方法主要特點比較（表1）。
1）ROS1基因重排/融合表達檢測各種方法學與ALK相似，但IHC抗體特異性不佳，目前不能直接用于檢測ROS1基因重排/融合表達，僅可用于ROS1基因融合初篩?；趒RT-PCR方法的ROS1融合基因檢測具有較高的靈敏度和特異度，且可與ALK聯檢。FISH檢測是檢測ROS1重排的“金標準”。二代測序檢測ROS1基因變異同樣可在DNA水平上檢測重排序列，也可在mRNA水平檢測融合序列，但由于ROS1基因序列的特殊性，基于DNA水平的二代測序檢測靈敏度受文庫探針設計及生物信息學分析能力影響較大，應注意假陰性。
2）MET跳讀突變：MET第14號外顯子跳躍突變的檢測，包括二代測序或qRT-PCR直接檢測缺失MET第14號外顯子的mRNA，或二代測序在DNA水平上檢測可能導致MET第14號外顯子剪切的基因變異。MET基因探針覆蓋范圍不夠可能導致基于DNA的二代測序發生漏檢，建議二代測序檢測應盡量涵蓋第14號外顯子外的如第13或14號內含子上可能發生剪切變異的區域。原位雜交檢測是檢測MET擴增的標準方法。相較于FISH，二代測序可用于MET擴增檢測，但與FISH檢測的對應性比較復雜，并可能遺漏MET多體，但是二代測序可同時檢測MET突變和融合等其他變異，且能實現多基因共檢，在臨床實踐中應用更廣。
3）蛋白過表達：NSCLC中蛋白過表達可用于指導臨床靶向治療的基因有HER、NTRK和PD-L1，通過IHC檢測腫瘤細胞和/或免疫細胞PD-L1的表達水平是目前判斷NSCLC患者能否從免疫檢查點抑制劑治療中得到更多獲益的主要評估手段。目前我國已批準3種標準化的PD-L1檢測商用試劑盒用于臨床檢測，包括配套Dako平臺的PD-L1 IHC 22C3 pharmDx試劑盒及濃縮液、PD-L1 IHC 28-8 pharmDx試劑盒以及配套Ventana檢測平臺SP263試劑盒。不同單抗和IHC染色平臺的使用、PD-L1染色陽性截斷值的設定與相應的免疫治療藥物療效相關。PD-L1檢測所用抗體克隆不同其陽性閾值不同。除了上述靶分子外，HER2基因突變或擴增、BRAF突變、KRAS突變、RET基因重排、NTRK家族基因重排等的檢測方法可參照基因點突變、基因重排類型的檢測方法和檢測策略，更多的尚需臨床實踐的積累。表1列舉了非小細胞肺癌常用分子病理檢測方法主要特點比較（表1）。
表1 非小細胞肺癌常用分子病理檢測方法主要特點比較
蘇公網安備 32011402011742